應(yīng)用介紹
2020年新冠病毒肆虐全球，激化了人類對于臨床研究目的的高通量 RNA 檢測和基因測序的需求。傳統(tǒng)手動操作方案難以提升RNA 檢測的效率。在本項研究中，我們展示了在 Opentrons OT-2 自動化移液工作站上使用 Beckman Coulter Life Sciences RNAd- vance Viral 試劑盒 (C63510) 的自動化 SARS-CoV-2 RNA 提取工作流程。 我們提供的分析數(shù)據(jù)顯示了通過 qRT-PCR 定量的SARS-CoV-2 檢測限(LoD) 和序列比對數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為自動測序樣品和文庫制備提供了依據(jù)，以便對突變株進行遺傳鑒定。

RNAdvance 病毒試劑盒和 OT-2 平臺概述
RNAdvance Viral kit 通過利用 SPRI 順磁珠技術(shù)，從樣品中高效提取病毒RNA。 我們在自動化的 Opentrons 平臺上使用了這種試 劑，從合成鼻基質(zhì)(110mM NaCl,1%w/v的豬胃I 型粘液 (Sigma M2378-100G) 和10μg/mL w/v人類基因組 DNA(Coriell NA12878), 以90%v/v 的TE/SNM) 樣品中提取了不同濃度的熱滅活的 SARS-CoV-2(ATCC°VR-1986HKTM) 。 每個濃度包括20 個測試樣品、2個陽性對照和2個陰性對照。

工作流程吞吐量
圖1顯示了自動化 RNAdvance 病毒提取工作流程的 OT-2甲板布局。該工作流程從向樣品裂解液中添加 Bind (BBB)開始，每個樣 品僅需要消耗10個吸頭，可靈活運行8個批次大小的最多96個樣本。報告中描述的工作流程持續(xù)時間包括實際操作時間、樣品裂解時間和優(yōu)化后樣品的運行時間(圖2)。
使用 RNAdvance Viral試劑盒和OT-2平臺，處理96個樣本的工作流程總共需要3.5小時，您可以復(fù)制鏈接到瀏覽器，查看具體協(xié)議流程： https://protocols.opentrons.com/protocol/bc-rnadvance-viral。您可以根據(jù)您的需求靈活地改變方法變量，以獲得您所需要的批次大小、樣品輸入和洗脫體積的所需結(jié)果。

該工作流程在 ?OT-2?上是可以全自動運行??的，每個樣品使用10個吸頭，并從加入Bind(BBB) ???開始。實驗甲板上耗材內(nèi)容有：最多10個吸頭架、1個?NEST?單孔儲液槽、2個?NEST 12?孔儲液槽、1個 NEST?0.1mL?PCR板和1個?NEST ?2mL?深孔板，模塊包括一個磁珠純化模塊和一個溫控模塊，配備一個?P300?多通道移液器。所有的?NEST 耗材和模塊都由?Opentrons 提供。

圖2:在OT-2平臺上使用RNAdvance Viral試劑盒的吞吐量情況
整個工作流程運行所需的時間包括3個部分：操作時間、裂解時間和運行時間。操作時間包括樣品和OT-2的準備工作。運行時間指的是 OT-2從開始到完成整個協(xié)議所需的時間。
A)處理8個樣品需要45分鐘，處理96個樣品需要2小時38分。
B) 圖形化展示了不同樣品數(shù)量下的運行處理時間。

RNAdvance 病毒試劑盒檢測限制
檢測限制(LoD)是用于確定OT-2平臺上自動化RNAdvance Viral提取效率的指標，它表示能夠在≥95%的重復(fù)測量中檢測到的病毒拷貝數(shù) 的最低濃度。我們使用2019-nCoV CDC N1和RP引物和探針(2019-nCoV CDC EUA kit,Integrated DNA Technologies (IDT)) 進行探 測 ，PCR 混合液和酶使用Luna°通用探針一步RT-qPCR 試劑盒(New England BioLabs),PCR反應(yīng)在PCRmax ECO48實時PCR 系統(tǒng)上 進行。在SARS-CoV-2 樣本 (n=20) 和陽性對照樣本 (n=2) 中檢測到病毒RNA (拷貝數(shù)/μL), 但在陰性對照樣本 (n=2) 中未檢測到。根據(jù)表1的總結(jié)，分析范圍內(nèi)的所有對比陽性樣本均被確定為陽性，其中最低濃度的病毒RNA 拷貝數(shù)為1拷貝/μL。PCR 參數(shù)如下。

表1:使用OT-2 平臺和 RNAdvance Viral 試劑盒檢測 SARS-CoV-2 目標 N1 的病毒靈敏度。1 copy/μL 是能夠檢測到≥95%樣本的最低濃度，被定義為檢測限制 (Limit of Detection,LoD)

為了研究 RNAdvance Viral在 OT-2 上的自動化性能，我們將850 copy/μL 濃度的熱滅活 SARS-CoV-2 病毒加入合成鼻腔基質(zhì)中，并提取RNA。 針對N1和RP, 確定了均值Ct值、標準差、變異系數(shù) (CV%) 和檢測率等規(guī)格參數(shù)(圖3A)。
在實驗樣本(n=20)、 陽性對照樣本(n=2) 和陰性對照樣本(n=2) 中，對N1 的擴增曲線進行定量分析(圖3B), 同時對包括對照樣本在內(nèi)的樣品中的RP進行定量分析(圖3C)。

DNA 測序和數(shù)據(jù)分析
為了進一步了解測序性能，我們使用Swift 2S Turbo DNA文庫制備試劑盒和 Swift Unique Dual Indexing 引物板進行 N1擴增。關(guān)于850 copy/μl 樣本的詳細數(shù)據(jù)和序列比對結(jié)果可以在圖4 中找到。我們觀察到平均覆蓋率為 455x, 并且平均讀數(shù)有91%與參考基因組 SARS-CoV-2 分離自Wuhan-Hu-1(NC_045512.2) 對齊。讀取長度與 N1擴增區(qū)域相匹配，大約為72個堿基。根據(jù)Swift 2s Turbo DNA 文庫制備試劑盒制造商的說明，預(yù)期插入片段大小約為 200bp。 測序是使用 lllumina MiSeq 進行的，并將篩選數(shù)據(jù)上傳至llluminaBaseSpace。在 Galaxy 中使用 Bowtie2 確定了覆蓋度，并使用 Integrative Genome Viewer(IGV) 進行可視化。NC_045512.2,SAR2-COV-2, 分離源自Wuhan-Hu-1 的基因組是用于測序的NCBI參考基因組。通過在 Galaxy 中使用QualiMap-BAMQC 工具，分析了調(diào)準、讀長、片段大小和CG含量等信息。

A) 綜合數(shù)據(jù) QC 表描述了多個數(shù)據(jù)點，包括455-x 的平均覆蓋率和與參考基因組對齊的平均讀數(shù)，SARS-CoV-2 分離株 Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) 為91%。根據(jù) Swift 2s Turbo DNA Library Prep 制造商的預(yù)期插入片段大小約為200bp。
B)每個樣本與參考基因組對齊的對比。

總結(jié)
本研究通過 Beckman Coulter Life Sciences RNAdvance Viral 試劑盒和 Opentrons OT-2 提供了一個穩(wěn)定、高性價比的自動化提取方 案。該工作流程經(jīng)過優(yōu)化，用于SARS-CoV-2 病毒 RNAPCR 檢測，在LoD (檢測限制)為每微升1個拷貝時進行了測量。我們使用了高 通量測序 (NGS) 進行測試，在平均樣本覆蓋度達到455 X 和平均讀數(shù)對齊到 SARS-CoV-2 參考基因組的91%。該研究表明，利用 RNAdvance Viral 試劑和 Opentrons OT-2 進行樣本提取可以實現(xiàn)高效且經(jīng)濟的 SARS-CoV-2 病毒 RNA 提取。同時，在測序分析方面， 該方案具有高平均覆蓋度和較高的對齊率，能夠為研究人員提供具有重要意義的遺傳信息。這對于致力于研究SARS-CoV-2 病毒的臨床研究人員來說，為他們的工作提供了一種高效、可行的樣本準備方案。