背景

已經(jīng)評(píng)估了兩種用于從鼻咽拭子中高通量提取 RNA 以檢測(cè) SARS-CoV-2 的自動(dòng)化內(nèi)部協(xié)議。

方法

在 10 天內(nèi)收集了 141 個(gè) SARS-CoV-2 陽(yáng)性樣本。內(nèi)部協(xié)議基于磁珠提取，設(shè)計(jì)用于 Opentrons OT-2（OT-2_內(nèi)部）液體處理機(jī)器人或 MagMAX ^TM Express-96 系統(tǒng)（MM_{內(nèi)部）。兩種協(xié)議均與使用 MagMAX} ^TM系統(tǒng)（MM_試劑盒）的商業(yè)試劑盒并行測(cè)試。核酸提取效率是根據(jù) SARS-CoV-2 DNA 陽(yáng)性對(duì)照計(jì)算的。

結(jié)果

在檢測(cè)陽(yáng)性樣本方面，內(nèi)部方案和商用試劑盒之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。MM 試劑_盒效率最高，盡管_{內(nèi)部 MM 試劑盒}的平均 Ct 值低于其他兩種試劑盒。與商用試劑盒相比，內(nèi)部方案每提取 96 個(gè)樣本可節(jié)省 350 歐元至 400 歐元。

結(jié)論

所述協(xié)議利用易于獲得的試劑和開(kāi)源液體處理系統(tǒng)，適用于高通量設(shè)施中的 SARS-CoV-2 檢測(cè)。

引用： Lázaro-Perona F、Rodriguez-Antolín C、Alguacil-Guillén M、Gutiérrez-Arroyo A、Mingorance J、García-Rodriguez J 等人。 （2021）評(píng)估兩種用于 SARS-CoV-2 檢測(cè)的自動(dòng)化低成本 RNA 提取方案。 PLoS ONE 16(2): e0246302。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246302

編輯： AM Abd El-Aty，埃及開(kāi)羅大學(xué)

收稿日期： 2020 年 11 月 5 日；接受日期： 2021 年 1 月 15 日；發(fā)表日期： 2021 年 2 月 16 日

版權(quán)所有：?? 2021 Lázaro-Perona 等人。這是一篇開(kāi)放獲取的文章，根據(jù)知識(shí)共享署名許可條款分發(fā)，允許在任何媒體中不受限制地使用、分發(fā)和復(fù)制，前提是注明原作者和出處。

數(shù)據(jù)可用性：所有相關(guān)數(shù)據(jù)均在論文及其支持信息文件中。

資金：作者未收到此項(xiàng)工作的特定資金資助。

競(jìng)爭(zhēng)利益：作者已聲明不存在競(jìng)爭(zhēng)利益。

介紹

SARS-CoV-2 疫情要求大規(guī)模使用 qPCR 檢測(cè)，以發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性病例并追蹤接觸者，從而阻止社區(qū)傳播。在 qPCR 檢測(cè)之前，通常需要對(duì)臨床樣本進(jìn)行 RNA 提取 [?1-4?]。考慮到每天檢測(cè)的樣本數(shù)量，大多數(shù)機(jī)構(gòu)無(wú)法采用手動(dòng) RNA 提取方法，因此，自動(dòng)化系統(tǒng)被廣泛用于此任務(wù) [?5-7?] 。自動(dòng)化系統(tǒng)的缺點(diǎn)是，它顯著增加了最終成本，這可能會(huì)阻礙某些地區(qū)的大規(guī)模檢測(cè)。此外，由于需求增加，提取試劑的庫(kù)存短缺導(dǎo)致診斷嚴(yán)重延遲。

本文介紹了兩種低成本的自動(dòng) RNA 提取方法。第一種方法使用 OT-2 系統(tǒng)（Opentrons，紐約州紐約市，美國(guó)），這是一種能夠自動(dòng)執(zhí)行自行設(shè)計(jì)方案的開(kāi)源液體處理機(jī)器人；第二種方法使用快速且易于使用的核酸提取儀 MagMAX ^TM Express-96 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國(guó)）。后者可在 30 分鐘內(nèi)提取多達(dá) 96 個(gè)樣本，但需要事先手動(dòng)分配試劑、磁珠和 96 孔板中的樣本，這會(huì)增加 30 分鐘。作為替代方案，OT-2_內(nèi)部方案可以完全自動(dòng)化地在 104 分鐘內(nèi)處理多達(dá) 48 個(gè)樣本。

方法

樣品采集

在十天內(nèi)，收集了 141 份連續(xù)的 SARS-CoV-2 陽(yáng)性鼻咽拭子，這些拭子帶有病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基（西班牙巴塞羅那 Deltalab），并儲(chǔ)存在 4°C 下。處理前，將 500 μL 病毒培養(yǎng)基和 500 μL 4M 異硫氰酸胍 (GTC)（德國(guó)希爾登 Qiagen）與 5 μg/mL 載體 RNA 混合，使樣品失活，然后將樣品在 80°C 下加熱 2 分鐘，并短暫渦旋混合。

設(shè)備和試劑

核酸自動(dòng)提取采用兩種系統(tǒng)：MagMAX ^TM Express-96 深孔磁粉處理器（King Fisher Instrument，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）和開(kāi)放式系統(tǒng) OT-2（Opentrons，美國(guó)紐約州紐約），配有 GEN1 磁模塊（Opentrons，美國(guó)紐約州紐約）和內(nèi)部協(xié)議。兩種系統(tǒng)均使用 MagMAX? Express 96 板和深孔板（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。

核酸提取采用三種方法：1）根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 MagMAX?^TM和商用 MagMAX CORE 核酸純化試劑盒 (MM_{試劑盒)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）；2）OT-2 系統(tǒng)采用通用試劑（OT-2內(nèi)部}），例如乙醇（Emsure?，Merck KGaA，德國(guó)達(dá)姆施塔特）、2-丙醇（Emsure?，Merck KGaA，德國(guó)達(dá)姆施塔特）、洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）、無(wú)核酸酶水（Ambion?^TM，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）和磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）；3）MagMAX?^TM采用與商用試劑盒相同的協(xié)議，但使用 OT-2 方法中的試劑（MM_內(nèi)部）。內(nèi)部協(xié)議是 Hui He 等人描述的程序的修改版[8]。簡(jiǎn)而言之，將滅活的呼吸道樣本以 1:1 的比例與異丙醇混合，至最終體積為 500 μl（_{內(nèi)部OT-2）和 1000 μL（內(nèi)部}MM），加入 40 μL 磁珠并在室溫下孵育 5 分鐘。接下來(lái)，用磁鐵將磁珠拉到管的一側(cè)并棄去上清液。然后用 500 μL 新鮮制備的 70% 乙醇洗滌磁珠兩次。第二次洗滌后，棄去 70% 乙醇并在室溫下風(fēng)干磁珠。最后，將珠子重新懸浮在 100 μL 洗脫緩沖液中并再次用磁鐵分離以回收洗脫的病毒 RNA（表1）。

表 1.所評(píng)估的三個(gè)方案中使用的步驟、試劑和體積（μL）。

協(xié)議設(shè)計(jì)和驗(yàn)證

MM_試劑盒協(xié)議：

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)深孔板，一個(gè)深孔板每孔裝有 500μL MagMAX? CORE Wash Solution 1，另一個(gè)深孔板每孔裝有 500μL MagMAX? CORE Wash Solution 2。準(zhǔn)備一個(gè) MagMAX? Express 96 微量滴定板，每個(gè)孔裝有 90μL MagMAX? CORE Elution Buffer。
2. 每個(gè)樣品準(zhǔn)備 20μL MagMAX? CORE 磁珠和 10μL MagMAX? CORE 蛋白酶 K 的混合物（珠子/PK 混合物）。
3. 為每個(gè)樣品準(zhǔn)備 300μL MagMAX? CORE 裂解溶液和 300μL MagMAX? CORE 結(jié)合溶液的混合物（裂解/結(jié)合溶液）。
4. 在深孔板中每孔分配 30μL 珠子/PK 混合物、700μL 裂解/結(jié)合溶液和 200μL 樣品。
5. 將所有板放入系統(tǒng)并運(yùn)行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

MM_內(nèi)部協(xié)議：

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)深孔板，每個(gè)孔加入 500μL 70% 乙醇。準(zhǔn)備一個(gè) MagMAX? Express 96 微量滴定板，每個(gè)孔加入 90μL 洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）。
2. 在深孔板中每孔分配 40 μL 磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）、500 μL 異丙醇和 500 μL 樣品。
3. 將所有板放入系統(tǒng)并運(yùn)行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

OT-2_內(nèi)部協(xié)議：

1. 將 40μL 磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）、250μL 異丙醇和 250μL 樣品分裝到深孔板中。用移液器吹打五次混勻，室溫下孵育 5 分鐘。
2. 激活GEN1磁性模塊4分鐘。
3. 收集上清液并棄去。
4. 加入500μL 70%乙醇，收集并丟棄。
5. 加入500μL 70%乙醇，收集并丟棄。
6. 風(fēng)干 4 分鐘。
7. 關(guān)閉GEN1磁性模塊并添加100μL洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國(guó)佐治亞州諾克羅斯）。
8. 30秒后打開(kāi)GEN1磁性模塊。
9. 90秒后收集上清液并轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板。

樣品輸入量是自動(dòng)移液系統(tǒng)允許的最大量，其他試劑的量也不同，因此三種方法的輸入量不同

OT-2內(nèi)部協(xié)議是根據(jù) Opentrons 說(shuō)明用 Python 編寫(xiě)的。腳本已存放在 GitHub 存儲(chǔ)庫(kù)中

為了驗(yàn)證內(nèi)部核酸提取方案的性能，使用 DNA 陽(yáng)性對(duì)照 TaqMan 2019-nCoV 對(duì)照試劑盒 v1（賽默飛世爾科技，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）制作了標(biāo)準(zhǔn)、低和極低病毒載量的模擬樣本。對(duì)照試劑盒的濃度為 1 x 10 ⁴拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)病毒載量樣本的制備方法是將 10 μL 陽(yáng)性對(duì)照與 490 μL 病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基和 500 μL GTC 混合。低和極低病毒載量的制備方式相同，但使用陽(yáng)性對(duì)照的十倍連續(xù)稀釋液。所有模擬樣本均制備三份，并與_內(nèi)部OT-2 、MM_{試劑盒和內(nèi)部}MM并行處理，然后使用 TaqMan 2019-nCoV 檢測(cè)試劑盒 v1 進(jìn)行 qPCR 測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)、低和極低病毒載量的模擬樣本中陽(yáng)性對(duì)照的最終濃度分別為 1 x 10 ⁶拷貝/mL、1 x 10 ⁵拷貝/mL 和 1 x 10 ⁴拷貝/mL。所有運(yùn)行均包括陰性對(duì)照。

通過(guò)將模擬樣本中陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值 (Ct _ss ) 與直接從庫(kù)存制備的陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算核酸提取效率，校正量以匹配稀釋因子和每個(gè)方案中使用的初始樣本量 (Ct _pc ) (R = 2 ^-ΔCt = 2 ^-(Ctss-Ctpc) )。

定量PCR

使用針對(duì)orf1ab、刺突 (S)、核衣殼 (N) 和人 RNaseP 基因的 TaqMan 2019-nCoV 檢測(cè)試劑盒 v1 以及作為陽(yáng)性對(duì)照的 TaqMan 2019-nCoV 對(duì)照試劑盒 v1，按照制造商推薦的 qPCR 條件對(duì) SARS-CoV-2 病毒 RNA 進(jìn)行核酸擴(kuò)增。所有 qPCR 檢測(cè)均在 CFX96 Touch 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng) (Bio-Rad，美國(guó)加利福尼亞州赫拉克勒斯) 中進(jìn)行。為了減少檢測(cè)間差異，提取的核酸樣本使用另一個(gè) OT-2 模塊自動(dòng)分配到 qPCR 試紙中。

統(tǒng)計(jì)分析

成對(duì)比較了這三種方案。使用 McNemar 檢驗(yàn)來(lái)比較它們將樣本分配為陽(yáng)性或陰性的表現(xiàn)。Ct 值不呈正態(tài)分布，因此使用 Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)來(lái)比較每個(gè)目標(biāo)的 Ct 值。對(duì)于每個(gè)目標(biāo)，僅考慮通過(guò)這三種方法擴(kuò)增的樣本。使用 bootstrap 方法計(jì)算中位置信區(qū)間。

所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試均采用 IBM SPSS Statistics 24.0.0.0 軟件包（SPSS Inc.，美國(guó)伊利諾伊州芝加哥）執(zhí)行。

結(jié)果

提取方案的效率

通過(guò)提取用模擬不同病毒載量的 SARS-CoV-2 陽(yáng)性對(duì)照制備的模擬樣本，將兩種內(nèi)部方案的核酸提取效率與 MM_{試劑盒方案進(jìn)行了比較。MM試劑盒}和 OT-2_內(nèi)部方案成功擴(kuò)增了所有具有標(biāo)準(zhǔn)病毒載量的模擬樣本中的orf1ab、S 和 N 靶標(biāo)。對(duì)于這些樣本，所有重復(fù)和基因的平均提取效率為 MM_{試劑盒33.9%（SD：13.8），OT-2內(nèi)部}方案19.6%（SD：2.2），MM_{內(nèi)部方案}16.0%（SD：5.03） 。

在低病毒載量模擬樣本中，MM_試劑盒無(wú)法擴(kuò)增所有樣本中的 S 靶標(biāo)，也無(wú)法擴(kuò)增其中一個(gè)重復(fù)樣本中的 N 靶標(biāo)，而 OT-2_內(nèi)部和 MM_內(nèi)部檢測(cè)出了所有基因。最后，MM_試劑盒和 OT-2_內(nèi)部方案無(wú)法擴(kuò)增極低病毒載量樣本，除了一個(gè)重復(fù)樣本，其中 N 基因可以通過(guò) OT-2_內(nèi)部方案擴(kuò)增，但 MM_內(nèi)部可以檢測(cè)到所有樣本中的陽(yáng)性對(duì)照，其中一個(gè)樣本含有三個(gè)靶標(biāo)，一個(gè)樣本含有 orf1ab和N 靶標(biāo)，最后一個(gè)樣本含有orf1ab靶標(biāo)（S1 表）。

臨床呼吸道樣本的核酸提取

收集的 141 份陽(yáng)性臨床樣本同時(shí)使用 MM_試劑盒、OT-2_內(nèi)部方法和 MM_內(nèi)部方法進(jìn)行核酸提取，并通過(guò) qPCR 檢測(cè)洗脫的 SARS-CoV-2 RNA。記錄每個(gè)目標(biāo)的陽(yáng)性/陰性結(jié)果和擴(kuò)增循環(huán)閾值 (Ct)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，當(dāng)三個(gè)目標(biāo)區(qū)域中至少一個(gè)擴(kuò)增且 Ct<40 時(shí)，樣本被視為陽(yáng)性。所有運(yùn)行中包括的陰性對(duì)照在所有情況下均產(chǎn)生陰性 PCR 結(jié)果。

141 個(gè)樣本中，123 個(gè)樣本通過(guò)至少一種提取方法檢測(cè)出 SARS-CoV-2 陽(yáng)性，而 18 個(gè)樣本通過(guò)三種方法檢測(cè)均為陰性。這可能是由于樣本在采集期間降解所致，因?yàn)樗鼈円言?4°C 下儲(chǔ)存了約 48 小時(shí) [9]。按方法分類(lèi)，114 個(gè)樣本使用 MM_{試劑盒檢測(cè)呈陽(yáng)性，111 個(gè)樣本使用內(nèi)部}OT-2 檢測(cè)呈陽(yáng)性，118 個(gè)樣本使用_內(nèi)部MM 檢測(cè)呈陽(yáng)性。成對(duì)比較發(fā)現(xiàn)它們檢測(cè) SARS-CoV-2 的性能沒(méi)有顯著差異（MM_試劑盒Vs OT-2_內(nèi)部，P =?0.5465；MM_試劑盒Vs MM_內(nèi)部，P =?0.3865；OT-2_內(nèi)部Vs MM_內(nèi)部，P =?0.0961）。18 個(gè)樣本通過(guò)三種方法中的一些方法檢測(cè)呈陰性。這些具有較高的 Ct 值，?orf1ab和 N 靶標(biāo)的中值分別為 38.68 和 38.19（在這些樣本中，S 靶標(biāo)未通過(guò)任何方法擴(kuò)增）。比較所有方法和靶標(biāo)的成對(duì)線(xiàn)性回歸和相關(guān)性分析顯示 R?²值在 0.85 和 0.95 之間，Bland-Altman 分析表明在整個(gè) Ct 范圍內(nèi)一致性是一致的（S1 圖）。

_{在使用 MM試劑盒}提取的樣本中，43% 可檢測(cè)到三個(gè)靶標(biāo)（orf1ab 、 N 和 S ），在使用_內(nèi)部OT-2 提取的樣本中，49%可檢測(cè)到，_{在使用內(nèi)部}MM 提取的樣本中，49% 可檢測(cè)到（圖 1）。在 34%、39% 和 30% 的樣本中檢測(cè)到了orf1ab和 N 靶標(biāo)，在 19%、10% 和 17% 的樣本中僅擴(kuò)增了 N 靶標(biāo)。只有極少數(shù)樣本因單獨(dú)擴(kuò)增orf1ab靶標(biāo)（6）、orf1ab?+ S（1）或 N + S（5）靶標(biāo)而被視為陽(yáng)性，并且沒(méi)有樣本以 S 基因作為唯一的陽(yáng)性標(biāo)記。事實(shí)上，該檢測(cè)中的 S 靶標(biāo)明顯缺乏靈敏度，并且與診斷決策無(wú)關(guān)。使用 OT-2_內(nèi)部協(xié)議檢測(cè)到兩個(gè)或三個(gè)目標(biāo)的樣本占 87%（97 個(gè)樣本），使用 MM_{內(nèi)部協(xié)議檢測(cè)到兩個(gè)或三個(gè)目標(biāo)的樣本占 82%（95 個(gè)樣本），使用 MM試劑盒}檢測(cè)到兩個(gè)或三個(gè)目標(biāo)的樣本占 79%?（90 個(gè)樣本）。

考慮配對(duì)樣本時(shí)，在 orf1ab ( P = 0.437)、N ( P = 0.686) 和 S ( P = 0.794) 靶標(biāo)的 Ct 值中，MM 試劑盒和 OT-2 內(nèi)部方案之間的 Cts 沒(méi)有顯著差異( 圖 2 )。與 MM 試劑盒 ( orf1ab?;?P?<?0.00001?,?N?;?_P?<?_0.00001?,?S?;?P?=?0.00148?)和OT?-?2內(nèi)部_方案(?orf1ab?;?P?<?0.00001, N;?P =?0.00008, S;?P =?0.00252)相比，MM_{內(nèi)部方案在所有靶標(biāo)中的 Cts 確實(shí)顯}著較低。

圖 2.箱線(xiàn)圖顯示使用 MM_試劑盒、OT-2_內(nèi)部方法和 MM_{內(nèi)部方法獲得的}orf1ab?、S 和 N 目標(biāo)的 Ct 值分布。y 軸顯示擴(kuò)增循環(huán) (Ct)。顯示每個(gè)數(shù)據(jù)集上的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量。

使用 MM_試劑盒、OT-2_{內(nèi)部試劑盒}和 MM_{內(nèi)部試劑盒對(duì)}orf1ab靶標(biāo)的中位擴(kuò)增循環(huán) (CI:95%)分別為 35.53 (33.82–36.36)、35.58 (34.33–36.21) 和 34.8 (33.71–35.29)。對(duì)于 S 基因，中位擴(kuò)增循環(huán) (CI:95%) 為 30.16 (28.56–33.08)、31.32 (29.22–32.88) 和 31.07 (29.36–32.90)；對(duì)于 N 靶標(biāo)，中位擴(kuò)增循環(huán) (CI:95%) 為 34.83 (33.93–35.97)、34.64 (33.42–35.29) 和 34.28 (33.52–35.10)。

開(kāi)采成本和實(shí)際操作時(shí)間

_{使用 OT-2內(nèi)部}協(xié)議提取 96 個(gè)樣本的核酸，總成本為 107 歐元（試劑 37 歐元和實(shí)驗(yàn)室器具 70 歐元），實(shí)際操作時(shí)間為 10 分鐘，提取時(shí)間為 3 個(gè)半小時(shí)（腳本每次運(yùn)行處理 48 個(gè)樣本，因此必須完成兩次）。MM_內(nèi)部成本為 66 歐元（試劑 37 歐元和實(shí)驗(yàn)室器具 29 歐元），MM 試劑_盒成本為 472 歐元（試劑 443 歐元和實(shí)驗(yàn)室器具 29 歐元）。兩種協(xié)議的實(shí)際操作時(shí)間均為 40 分鐘，提取時(shí)間均為 30 分鐘。值得注意的是，雖然 96 個(gè)樣本的 OT-2 協(xié)議比 MM_內(nèi)部協(xié)議貴 40 歐元，但所需的初始投資明顯較低，OT-2 系統(tǒng)（包括模塊和移液器）約為 10,000 歐元，MagMAX ^TM系統(tǒng)約為 50,000 歐元。

討論

本文介紹了兩種低成本病毒 RNA 提取和臨床樣本 SARS-CoV-2 檢測(cè)方法，其性能與商用試劑盒相當(dāng)。盡管內(nèi)部方案提取 DNA 對(duì)照的效率低于商用試劑盒，但在臨床樣本中，整體靈敏度并未受到影響，這可能是因?yàn)閮?nèi)部方案使用更大的樣本起始量來(lái)彌補(bǔ)較低的效率。

設(shè)置 OT-2 系統(tǒng)進(jìn)行 RNA 提取需要對(duì)沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì)進(jìn)行密集編程，但提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的替代方案，能夠在一次運(yùn)行中提取 48 個(gè)樣本。這項(xiàng)工作中使用的腳本已上傳到開(kāi)放訪問(wèn)軟件存儲(chǔ)庫(kù) GitHub，在那里可以找到許多用于這些和類(lèi)似應(yīng)用程序的協(xié)議。這應(yīng)該有助于其他工作人員避免或減少編程步驟。該協(xié)議幾乎不需要?jiǎng)邮謺r(shí)間，并且使用容易獲得的試劑。此外，與其他提取系統(tǒng)相比，該設(shè)備所需的投資較低，使其適用于中低資源設(shè)施。MagMAX?^TM?Express-96 是一種快速、半自動(dòng)設(shè)備，每次運(yùn)行能夠提取 96 個(gè)樣本。MM_試劑盒提供用于滅活、裂解、洗滌和洗脫的試劑，可以以具有競(jìng)爭(zhēng)力的成本用于不同的基質(zhì)和樣品類(lèi)型。另一方面，MM_內(nèi)部協(xié)議利用該系統(tǒng)的半開(kāi)放方法，用其他化學(xué)品替代商業(yè)解決方案，使其更具成本效益。在這兩種情況下，都必須手動(dòng)準(zhǔn)備深孔板、緩沖液和樣品，這會(huì)增加總提取時(shí)間和操作錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)。這兩種內(nèi)部協(xié)議的主要缺點(diǎn)是，當(dāng)處理粘稠樣品時(shí)，粘液、高粘性多糖、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、蛋白酶和含有大量細(xì)胞核酸的細(xì)胞碎屑會(huì)阻礙 RNA 提取或抑制 PCR 反應(yīng) [?10-12?]?。為了部分克服這個(gè)問(wèn)題，可以在提取前對(duì)樣品進(jìn)行加熱和渦旋或離心，但這會(huì)增加動(dòng)手時(shí)間和響應(yīng)時(shí)間。當(dāng)使用_內(nèi)部MM時(shí)，洗脫樣品在某些情況下可能含有痕量的磁珠，但這不會(huì)影響 RT-PCR 反應(yīng)的性能。

在這三個(gè)系統(tǒng)中，陰性對(duì)照在所有情況下均為陰性，表明在這些系統(tǒng)中處理原始樣本時(shí)不存在交叉污染問(wèn)題。不過(guò)，與非自動(dòng)化系統(tǒng)一樣，應(yīng)采取預(yù)防措施，將 PCR 前和 PCR 后操作分開(kāi)。如果使用 OT-2 模塊設(shè)置 PCR 后反應(yīng)（例如測(cè)序），則不應(yīng)使用它從樣本中提取核酸，除非徹底凈化。

研究?jī)?yōu)勢(shì)和局限性

這項(xiàng)研究的主要優(yōu)勢(shì)在于，這些方法都是在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中用真實(shí)樣本進(jìn)行測(cè)試的。方法之間的比較并不系統(tǒng)，這是一個(gè)重要的限制。事實(shí)上，設(shè)計(jì)的目的是優(yōu)化每個(gè)系統(tǒng)的結(jié)果，因此輸入是不同的。系統(tǒng)地探索輸入樣本量以及其他試劑量將是有益和有益的，但這超出了這項(xiàng)研究的目的，即比較臨床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中系統(tǒng)與真實(shí)樣本的性能。

結(jié)論

總之，這里介紹的兩種內(nèi)部核酸提取方法可有效實(shí)現(xiàn) SARS-CoV-2 的高通量診斷，且成本僅為其他商業(yè)試劑盒的一小部分，且不損失靈敏度。