分子克隆是合成生物學的核心，因為它包括 DNA 的組裝及其在靶宿主中的表達。然而，目前克隆通常是一個手動、耗時且重復的過程，自動化將極大地促進這一過程的發(fā)展。完整的合理克隆過程（即從 DNA 創(chuàng)建到在靶宿主中表達）的自動化涉及不同操作和機器的集成。此類工作流程的示例很少，尤其是當設計合理（即DNA 序列設計是固定的，而不是基于隨機庫）且靶宿主在遺傳上不太易于處理（例如，對熱休克轉化不敏感）時。在本研究中，介紹了一種自動化工作流程，用于合理構建質(zhì)粒并將其隨后接合轉移到生物技術平臺生物谷氨酸棒狀桿菌中。整個工作流程都配有定制的軟件工具。作為應用示例，構建并表征了基于調(diào)節(jié)器 Lrp 的合理設計的轉錄因子生物傳感器庫。獲得了具有改進的動態(tài)范圍的傳感器，并且從篩選中獲得的見解為谷氨酸棒桿菌Lrp的雙重調(diào)節(jié)功能提供了證據(jù)。

介紹
大宗和精細化學品的微生物生產(chǎn)是實現(xiàn)更可持續(xù)的全球經(jīng)濟的重要組成部分。為了促進這一發(fā)展，必須提高對微生物生命的基本理解及其工程設計以滿足社會需求。近年來，人們提出了采用設計-構建-測試-學習 (DBTL) 循環(huán)作為實現(xiàn)這一目標的工具。（1）分子克隆在這一循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，因為它可以生成具有不同特性的新基因型以供探索。
目前已開發(fā)出多種軟件工具來幫助進行基因型的電子克隆，其數(shù)量很容易超過實驗室中手動克隆的數(shù)量。（2）現(xiàn)在，在短時間內(nèi)設計數(shù)百種基因型已成為可能。例如，一條由 5 個基因組成的生產(chǎn)途徑，每個基因具有 3 個不同的核糖體結合位點 (RBS)，已經(jīng)產(chǎn)生了 3 5 = 243 種變體。然而，這種項目的設計相對簡單，現(xiàn)在瓶頸轉移到實際體外創(chuàng)建這些序列及其在所需工業(yè)宿主中的表達。（3）
可以通過使用一鍋組裝和篩選方法來解決該問題，即獲得許多但不一定是全部的變體，并使用篩選試驗來選擇表現(xiàn)最佳的變體。（4）然而，這些方法有一個缺點：知識僅來自成功構建并從一鍋反應中分離的少數(shù)變體。更難構建的變體在這種反應中較少，因此不太可能篩選出它們的特性。對于許多基本的生物學問題，這不是一個理想的解決方案。在這里，合理的菌株構建和工作流程所有步驟內(nèi)所有品種的完整可追溯性是必要的，就像經(jīng)典分子克隆所實現(xiàn)的那樣。
然而，目前分子克隆通常是一個手動、耗時且重復的過程，自動化將為其帶來巨大好處。（5）合理克隆工作流程的自動化具有多種好處。實驗人員在菌株構建上花費的動手時間可以大大減少。再加上可以實現(xiàn)更高的吞吐量，這大大增加了可以及時生產(chǎn)的構建體的數(shù)量。此外，自動化通過消除過程中的隨機變化引入了流程的標準化。這些過程也可以更容易地監(jiān)控和分析，從而更容易找到改進的空間。因此，自動化可以提高克隆工作流程的數(shù)量和質(zhì)量。
近年來，微流體技術已用于實現(xiàn)克隆過程的自動化。（6,7）在這里，定制的微流控芯片用于為單個單元操作提供液體分離和液體轉移。雖然這種技術具有將許多單元操作組合在一個設備中的優(yōu)勢，并且能夠擴展到每個芯片進行大量實驗，但需要高度專業(yè)的基礎設施和人員來制造芯片并進行實驗。
一種更模塊化、更方便的解決方案是使用標準液體處理系統(tǒng)，如果需要，還可以使用輔助設備。這樣的系統(tǒng)可能相當復雜，能夠執(zhí)行大量具有不同任務的實驗，（8?11）而且還有更具成本效益的解決方案可供選擇。（12）最近提出的策略利用特定細菌的自然轉化能力，從而產(chǎn)生一種高效且易于使用的克隆方法。（13）然而，這種方法僅限于主動吸收外源 DNA 的少數(shù)生物。
迄今為止發(fā)布的大多數(shù)自動克隆工作流程都集中于大腸桿菌。（14）大腸桿菌是一種成熟的分子克隆宿主，在遺傳學上非常容易操控。許多遺傳工具已被開發(fā)和優(yōu)化用于大腸桿菌，并且有全面的組學數(shù)據(jù)可用。然而，由于大腸桿菌的低壓力耐受性和噬菌體感染風險，它并不總是工業(yè)過程的理想宿主。（15）因此，擴展自動化平臺以涵蓋對其他遺傳上較難處理的微生物進行工程改造將是有益的。
谷氨酸棒狀桿菌是一種廣泛使用的工業(yè)細菌（16）由于其對熱休克轉化等自動化友好型轉化過程具有抵抗力，因此其改造難度比大腸桿菌更大。雖然已經(jīng)朝這個方向采取了一些措施，（17）它們通常無法實現(xiàn)實際目標生物轉化過程的自動化，最常見的原因是，電穿孔（針對此類生物的首選方法）不易實現(xiàn)自動化。
本研究提出了一種完整的工作流程，用于自動化合理構建抗熱休克微生物菌株。所有工作均使用標準液體處理系統(tǒng)進行。PCR 和 Gibson 組裝用于構建 96 個質(zhì)粒的文庫。開發(fā)了用于大腸桿菌熱休克轉化的自動化方案作為穿梭系統(tǒng)。菌落 PCR 和測序用作質(zhì)量控制。對于轉化谷氨酸棒桿菌的最后一步，開發(fā)了一種新穎的高通量接合工作流程。接合是一種描述良好且高度相關的細菌轉化技術。（18）這種方法效率很高，但由于需要使用瓊脂板和濾紙，因此通常比較費力。在本研究中，我們通過使用離心法簡化了操作并使其自動化。整個工作流程都配有一個定制的軟件工具，用于跟蹤所有構建體及其在過程中的狀態(tài)。
作為應用示例，顯示了谷氨酸棒桿菌中不同 Lrp 生物傳感器變體的組裝和表達。Lrp 生物傳感器之前已開發(fā)用于檢測谷氨酸棒桿菌中的l -蛋氨酸和支鏈氨基酸。(19)該傳感器將細胞內(nèi)l -蛋氨酸和支鏈氨基酸濃度與eyfp的表達相結合，后者編碼一種熒光報告蛋白。細胞內(nèi)濃度增加會導致熒光信號增強。一般而言，生物傳感器的設計相對模塊化；可以通過修改核糖體結合位點和啟動子長度等來改變其特性。（20,21）此外，通過設計，它們提供了基因型和表型之間的直接且易于測量的關系；即Lrp 傳感器設計的變化可能會導致不同的可測量熒光輸出。因此，選擇不同 Lrp 生物傳感器的合理設計作為應用示例，以展示我們的克隆自動化方法的優(yōu)勢。

結果與討論
自動化基因工程工作流程
本研究開發(fā)的自動克隆工作流程（圖1）可分為兩個階段：質(zhì)粒在大腸桿菌中的組裝和擴增以及將質(zhì)粒轉移到目標生物體（本例中為谷氨酸棒桿菌）中。質(zhì)粒的構建是通過計算機設計部件、通過 PCR 構建片段以及通過 Gibson 組裝整合到骨架載體中。之所以選擇 Gibson 組裝，是因為它允許質(zhì)粒無疤痕組裝。(22)隨后通過熱休克轉化為大腸桿菌。將所得克隆通過冷凍保存，并通過菌落 PCR 進行第一步質(zhì)量控制。之所以選擇這種方法，是因為其成本效益高且運行時間短。該菌落 PCR 的結果影響了接下來的步驟：只有菌落 PCR結果為陽性的大腸桿菌克隆，即得到的 DNA 片段具有預期大小，表明片段成功組裝到主鏈中，才會被考慮用于自動質(zhì)粒制備，并同時結合到谷氨酸棒桿菌中。純化的質(zhì)粒用于測序作為最終的質(zhì)量控制。之后，篩選自動構建的菌株以表征改變的特性。最重要的是，每個單元操作都被設計為獨立的，因此可以在脫離工作流程時使用。

自動化單元操作由低成本液體處理設備 Opentrons OT-2 和基于前面描述的 Tecan EVO 200 的更復雜的液體處理平臺執(zhí)行或支持。（23,24）這兩個系統(tǒng)有著根本的不同：??OT-2 使用兩個帶一次性吸頭的空氣置換移液器?？捎靡埔浩鞯娜萘糠秶c手動移液器相似，操作員必須選擇適合實驗的移液器。它沒有機械手；因此，它不能改變平板的位置，例如，將平板放在加熱塊上或離心機中。平臺最多可容納九個微量滴定板。本研究使用的模型沒有配備冷卻實驗室器皿的選項。設計并 3D 打印了一個可裝滿冰和接頭適配器的定制冷卻架（參見支持信息） ，以便在必要時（例如，用于 Gibson 組裝）冷卻試劑。本研究中使用的配置中的 EVO 200 有一個基于液體的液體處理系統(tǒng)，容量范圍為 3 至 990 μL。它配備了一臺離心機、一個冷卻載體和一個加熱器/振動裝置，兩者都可供集成的機器人操縱臂使用。根據(jù)所用的載體，該平臺可以容納 15 個或更多的微量滴定板。為了將細菌培養(yǎng)物點到 100 毫米圓形培養(yǎng)皿上，我們設計了一個定制適配器并進行了 3D 打印（參見支持信息）。
決定使用兩種不同的液體處理系統(tǒng)是出于最高效利用實驗室設備的需求：只要有可能，就使用 OT-2 進行單元操作。與更昂貴的 EVO 200 相比，這節(jié)省了時間，因此可用于要求更高的實驗。在本研究中，單元操作“菌落采摘”是手動完成的。它可以通過專用設備自動完成，但當時沒有這些設備。
基于轉錄因子的生物傳感器的合理組合設計為了證明我們的工作流程的適用性，設計、構建并在谷氨酸棒桿菌中表達了不同版本的 Lrp 生物傳感器。Lrp 生物傳感器將細胞內(nèi)l -蛋氨酸、l -亮氨酸、l -異亮氨酸和l -纈氨酸濃度與熒光報告蛋白 eYFP 的表達相結合。為了構建不同版本的 Lrp 生物傳感器，對傳感器的不同部分進行了修改。Lrp 生物傳感器由lrp基因（編碼 Lrp 轉錄因子）、發(fā)散表達的eyfp基因（編碼熒光報告基因）和基因間區(qū)（包含lrp啟動子和eyfp上游的brnF啟動子以及eyfp RBS）組成(19)（圖2 ）針對lrp起始密碼子和 RBS、brnF啟動子和eyfp RBS設計了不同的變體。

對于lrp起始密碼子，選擇了三種變體：天然起始密碼子 ATG（應導致最高表達）、起始密碼子 GTG（應導致較低表達）和 TGT（應導致非常低或無表達）。這些起始密碼子變體中的每一個都與三種不同的lrp RBS 組合，同樣從最高表達到最低表達：GCTAAAATGG（最強）、GCTATTGTGC（天然，較弱）和 CAATCCTACC（最弱）。lrp側的三個起始密碼子和三個 RBS 的組合產(chǎn)生了 3 × 3 = 9 種不同的引物。
eyfp基因在brnF啟動子的控制下表達，該啟動子含有 Lrp 蛋白的結合位點。(25)因此，當啟動子序列縮短或延長時，可以添加或移除結合位點。由于brnF轉錄為無前導轉錄本，并且brnF的第一部分可能具有調(diào)控功能，(26)標準Lrp傳感器的eyfp啟動子包含brnF的前30bp 。本研究設計了四種不同的變體，從+30（標準Lrp生物傳感器啟動子）開始，以15為步長設計縮短版本，即+15、0和?15。對于eyfp的RBS，選擇了三種變體：AAAAGGAGAT（最強）、AGAAGGAGAT（天然，強度較低）和ATCCGACCAT（最弱）。四種啟動子長度和eyfp側三種RBS的組合產(chǎn)生了4×3=12種不同的引物。這種設計策略總共包括9×12=108種不同的Lrp生物傳感器變體。
每種變體都可以通過單個 PCR 反應構建，并且所有 PCR 反應都可以使用相同的 PCR 模板，即質(zhì)粒 pJC1- lrp - brnF′ - eyfp。為了組裝生物傳感器質(zhì)粒，每個 PCR 反應之后都會進行雙片段 Gibson 組裝，其中 PCR 產(chǎn)物被組裝到 pEC-Tmob18- lrp - eyfp主鏈中；所有 PCR 產(chǎn)物都經(jīng)過設計，因此它們可以組裝到相同的主鏈中。

大腸桿菌的DNA組裝與轉化
在構建 Lrp 生物傳感器變體之前，通過將lrp和eyfp插入可移動的 pEC-Tmob18 骨架來構建骨架質(zhì)粒。在兩個基因之間插入一個包含兩個 NcoI 限制位點的短間隔區(qū)。此序列允許質(zhì)粒線性化，并在下一步中插入包含不同lrp起始密碼子、lrp RBS、brnF啟動子長度和eyfp RBS 的不同版本的序列變體。
108 種變體中，96 種被選為自動克隆工作流程的應用示例，因為大多數(shù)自動化設備都是為 96 孔多滴定板設計的。PCR 變體構建、Gibson 組裝和大腸桿菌熱休克轉化連續(xù)進行。Opentrons OT-2 能夠在 85 分鐘內(nèi)自動移液 96 個 PCR 反應，然后將平板手動轉移到熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)后，使用 OT-2 混合 96 個 Gibson 組裝反應，這需要 50 分鐘。通過手動將平板轉移到熱循環(huán)儀進行孵育。在 50 °C 孵育步驟之前對 Gibson 主混合物進行適當冷卻至關重要；否則，就無法獲得大腸桿菌轉化子。在我們的工作流程中，冷卻是通過將所有實驗室器皿放入裝滿冰的 3D 打印小盒子中實現(xiàn)的。大腸桿菌熱休克轉化是在 TECAN EVO200 液體處理機器人上進行的，該機器人實現(xiàn)了完全無人操作的過程，從 Gibson 組裝混合物和感受態(tài)細胞開始，到將細胞點在瓊脂板上準備過夜孵育結束。這個過程耗時 170 分鐘?？偣苍?8 小時內(nèi)完成了 96 個構建體的 PCR、Gibson 組裝和轉化，僅需 40 分鐘的手動操作時間。
實施熱激步驟的合適方法是將 V 型底 96 孔板放在加熱裝置上預熱，將 8 種細胞-質(zhì)?；旌衔飶睦鋮s載體一次一個地轉移到加熱板上，孵育 30 秒，然后將其轉移回冷卻載體。雖然將整個板從冷卻載體轉移到加熱裝置更快，但這會產(chǎn)生不太可靠的熱傳遞結果。通過離心濃縮細胞懸浮液，將其重新懸浮在 LB 培養(yǎng)基中，然后點在瓊脂板上，即通過在單個瓊脂板的同一行上移取 6 個 5 μL 的點。
此外，使用大腸桿菌感受態(tài)細胞（NEB 5-alpha 感受態(tài)大腸桿菌）和 pUC19 標準載體測試了熱休克轉化的參數(shù)。測試了熱休克溫度（37、42 和 47 °C）和熱休克持續(xù)時間（0 到 30 秒，步長為 5 秒）。令人驚訝的是，在每種條件下都成功轉化的情況下，菌落形成單位幾乎沒有差異。最終，選擇了與標準手動程序最相似的條件。